专利名称：一种鸭茅组织培养再生体系的建立方法

专利号：ZL 201610723586.3

授权日期：2018年7月3日

专利类别：国家发明专利

专利权人：四川农业大学

发明人：张新全，冯光燕，汪霞，黄琳凯，许蕾，黄婷，马啸

技术领域：本发明属于生物技术领域，具体涉及一种鸭茅组织培养再生体系的建立方法。本发提供一种利用鸭茅种子获取愈伤组织并在此基础上完成分化与再生的方法，可极大的缩短鸭茅组织培养的周期。

背景技术：鸭茅具有生长迅速、分蘖能力强、产量高、耐瘠薄等优良特性，是中国南方草地农业生产中广泛使用的草种。随着分子生物学的发展，许多涉及到基因功能验证的实验需要通过组织培养进行遗传转化。传统的组培方式多以鸭茅的幼嫩花穗，茎节或者幼苗为外植体进行愈伤的诱导，进而通过分化得到完整的植株，但这些方式也存在外植体的选取受季节的限制不能全年提供足够的外植体进行实验，同时实验也相对比较耗时。因此，我们以种子为外植体，直接诱导愈伤进而得到完整的植株。克服了外植体供给的季节限制，同时也可以大大缩短实验周期。

发明内容：本发明专利的实现步骤如下：

1、采用鸭茅成熟种子作为外植体，将种子清洗灭菌后接种到诱导培养基中暗培养26～30 d得到愈伤组织，诱导培养基由N6培养基、Vb stock、30 g/L的蔗糖、200 mg/L的酸水解络蛋白、500 mg/L的脯氨酸、7.0 mg/L的2，4-D、4.5 g/L的琼脂组成，PH=5.8。具体步骤为，将鸭茅成熟种子放入瓶中，无水乙醇浸泡1分钟，取出用蒸馏水洗净，置于4℃冰箱中进行泡种24 h。泡种结束后，将鸭茅成熟种子取出放入70%的乙醇溶液中浸泡1 min，再取出放入1%的NaClO溶液中浸泡30 min，最后将鸭茅成熟种子取出后用双蒸水清洗3-5次，并将其置于灭菌滤纸，晾干多余水分。将鸭茅成熟种子清洗灭菌后接种到诱导培养基中暗培养12～16 d后，剪去鸭茅成熟种子上发出的新芽并更换新的诱导培养基继续培养12～16 d后得到愈伤组织。

2、将愈伤组织转入继代培养基中培养5～9 d，继代培养基由MS培养基、30 g/L的蔗糖、5.0 mg/L的2，4-D、1.0 mg/L的6-BA、1.0g/L的活性炭、4.5 g/L的琼脂组成，PH=5.8。

3、将经过步骤2处理的愈伤组织转接到分化培养基中培养18～22 d，分化培养基由MS培养基、30 g/L的蔗糖、0.2 mg/L的NAA、0.5 mg/L的GA、1.0 mg/L的6-BA、4.5 g/L的琼脂组成，分化培养基PH=5.8。

4、当幼苗长至2～3 cm时，将其移栽。

本发明的作用机理：植物成熟胚（种子）具有植物细胞全能性，包含本物种的全部遗传信息以及具备发育成完整植株的潜力。本发明通过直接对鸭茅种子进行诱导，获取愈伤组织完成分化与再生。通过上述方法建立高效的鸭茅组织培养再生体系，为建立鸭茅组织高效遗传转化体系奠定基础，为选育鸭茅组织优良品种提供了技术参考，同时克服了外植体供给的季节限制，同时也大大缩短了实验周期。

联系人：张新全 467199011@qq.com冯光燕 314414966@qq.com

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